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点击次数：6420 发布时间：2021/12/8 13:57:48
A、试剂制备
A基质胶：将A基质胶溶于37℃水浴槽回温10分钟， 确认融解.
C缓冲溶液(1X)制备：使用将10X C缓冲溶液用冰的无细胞培养液(例如： 无血清DMEM、opt-MEM) 制备成 1X C 缓冲溶液。(不要用 PBS 稀释 C 缓冲液) .
D 缓冲溶液(1X)制备: 使用用冷的 1x PBS 稀释 10X D 缓冲溶液至 1X D 缓冲溶液.
B、Biozellen®3D类器官培养基质胶的制备
全部步骤需要在无菌环境内操作，操作步骤如下：
1. 将24孔培养板放置于冰上预冷。
2. 细胞计数后取 2×105~2×107 细胞与 0.5 毫升 37℃ 培养基均匀混合，并与0.5毫升37℃ A胶按照 1:1 等比例均匀混合，终细胞密度105~107cells/mL。
注：请选择适当的培养溶液与条件进行试验，贴壁细胞应在~80% 汇合度下培养。
3.取 20-40 微升步骤 2 含细胞的混合 A 胶溶液滴于 步骤 1 预冷的培养板上，胶体将于 5 分钟内成胶。 注: 测试胶体是否成胶，可用微量吸管尖温和的触碰胶体表面进行确认。
4.待胶体成胶后，添加1毫升冰的1X C缓冲溶液，并盖过步骤3 的胶溶液，固定 15 分钟。
5.待15分钟固定后，小心的吸取 C 缓冲溶液并置换为适合此细胞生长之培养基溶液。
6.将含有细胞的胶于37°C 二氧化碳培养箱内进行7~14天的培养，并观察细胞球体的形成，按正常培养基更换频率进行更换操作。
C、溶胶与收集细胞球体准备程序
小心的将培养基吸取移除，并用1X PBS进行清洗。
小心的将 1X PBS 吸取移除，并添加 1 毫升冰的D缓冲溶液，盖过胶滴于室温反应 5分钟。
温和的用1毫升移液管吸取，直到胶滴溶解。
将含有细胞球体的溶液吸入1.5 毫升离心管，用1000 rpm的转速离心10分钟，移除上清液体并收集细胞球体做分析。
D、收集单颗细胞准备程序
在分离单细胞，先按上述溶胶与收集细胞球体准备程序进行操作
1. 添加trypsin-EDTA并与收集的细胞球体于37°C混合反应。
2. 用1毫升移液管混合，直到细胞体分解。
3. 待细胞球体分解，加入3倍体积的1X PBS，并用1000转的转速进行离心10分钟，并移除上清液体收集沉淀的单细胞做分析。
案例分享
A.形成3D肿瘤球体成功案例分享
B.Biozellen基质胶被溶解后分离的完整3D细胞结构照片
培养后的3D细胞球体， 在Biozellen基质胶被试剂盒里面的
D Buffer溶解分离后仍然可以得到完整的3D细胞结构
原创作者：上海创凌生物科技有限公司
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